real-time qpcr如何進行數(shù)據(jù)分析
1. real-time qpcr常見參數(shù)
基線（baseline）
通常是3-15個循環(huán)的熒光信號
同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線
閾值（threshold）
自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強
同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。
分析定量時候一般取ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準確。
rn（normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。△rn：△rn是rn扣除基線后得到的標準化結(jié)果（△rn=rn-基線）。2. 影響ct值的關(guān)鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內(nèi)，使ct在15-35之間
反應(yīng)液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的ph值和鹽濃度。
pcr反應(yīng)的效率
pcr反應(yīng)的效率也會影響ct值。在pcr擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與pcr擴增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。pcr效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。3. 如何評估實時定量pcr反應(yīng)的效果
pcr擴增效率：為了正確地評估pcr擴增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
另一個評估pcr效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)r2，它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果r2等于1，那么你可以用y值（ct）來準確預(yù)測x值（量）。如果r2等于0，你就不能通過y值來預(yù)測x值。r2值大于0.99 時，兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。
標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精確度計量方法。
如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值，那么標準偏差就??；如果許多數(shù)據(jù)點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)?？赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果pcr反應(yīng)效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均ct間隔應(yīng)該恰為1個ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于 0.250
real-time qpcr如何進行數(shù)據(jù)分析