快速可靠的分析是工藝開發(fā)過程中的關(guān)鍵。外泌體工藝開發(fā)的過程監(jiān)控也是一大挑戰(zhàn)。各類囊泡的尺寸都超出了體積排阻色譜的分辨范圍。外泌體吸收很少的紫外線，這使得它們難以從有更豐富和更強(qiáng)的吸收紫外線能力的宿主蛋白質(zhì)和dna（尤其是以殘留染色質(zhì)的形式）中進(jìn)行色譜檢測和區(qū)分，特別是以殘余染色質(zhì)的形式。
外泌體和其他囊泡類型是復(fù)合脂質(zhì)膜組合體，并含有自身的核酸和多種蛋白質(zhì)。它們在很寬的分子量范圍內(nèi)產(chǎn)生會多個(gè)不同強(qiáng)度的條帶，這使得不同囊泡類型之間的電泳條帶很難區(qū)分，尤其是在污染宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的背景下。其中一些阻礙可以克服，但這需要時(shí)間。
對于外泌體特異性抗原，可以通過蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）增強(qiáng)電泳，但這很費(fèi)力，需要將測定時(shí)間增加到至少兩天。elisa 可以自動化以增加通量，但仍然需要將近兩天的時(shí)間。斑點(diǎn)印跡法（dot-blotting）缺乏western blotting和 elisa 的靈敏度和特異性，并且仍然需要一天中的黃金時(shí)間。此外，建立高質(zhì)量的抗體庫這本身就是一個(gè)項(xiàng)目。這些額外的要求大大增加了分析負(fù)擔(dān)，也會往往阻礙對純化選項(xiàng)的深入探究。
bia本系列的三篇文章聚焦于外泌體分析純化的挑戰(zhàn)。本文是該系列的第二篇，介紹可實(shí)現(xiàn)外泌體在線色譜檢測的新分析方法。一種方法可以將細(xì)胞外囊泡與非囊泡污染物區(qū)分來，一種方法有可能將外泌體與其他囊泡區(qū)分開來。示例說明了如何能夠開發(fā)更有效和更有據(jù)可查的純化方法。
外泌體過程監(jiān)測的新分析方法：
在線 sec-mals/uv
多角度光散射 (mals) 代表了一種色譜分析過程中用于檢測樣品大小的新選擇。激光束穿過樣品時(shí)，檢測器從多個(gè)角度讀取散射信號。信號強(qiáng)度隨樣品大小而增加。該技術(shù)通常與體積排阻色譜（ sec） 結(jié)合使用。圖 1 疊加了應(yīng)用于 sec 柱的含有細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的外泌體 mals 和 uv 圖。在樣品成分太大而無法進(jìn)入顆?？走M(jìn)行洗脫的空隙峰中，mals能夠顯著提高靈敏度。然而需要強(qiáng)調(diào)的是，該峰不僅僅由外泌體組成：它包含所有細(xì)胞外囊泡和高分子量聚集體，還可能進(jìn)一步包括病毒、脂質(zhì)-脂蛋白結(jié)合和細(xì)胞碎片。然而，mals 使得一些只能通過uv吸光度法微弱地檢測到的產(chǎn)物群體變得可見。mals 還可用于獲取有關(guān)峰內(nèi)產(chǎn)物大小分布的信息。為了提供有關(guān)任何單一產(chǎn)物大小的有效信息，它必須以純化合物的形式被洗脫。
混合物產(chǎn)生的結(jié)果表示組分的平均大小，根據(jù)每個(gè)組分在整個(gè)樣本中所占的比例進(jìn)行重量平均，但 mals 仍然可以提供有用的信息。圖2將部分純化外泌體制備物的sec實(shí)驗(yàn)中的旋轉(zhuǎn)半徑圖與散射強(qiáng)度進(jìn)行了對比。請注意，表觀尺寸通過空隙峰的前側(cè)迅速下降，表明較大的產(chǎn)物在該區(qū)域富集。峰的其余部分似乎由與外泌體大小范圍相同的產(chǎn)物組成。應(yīng)該理解的是該圖中較大顆粒的尺寸大小因?yàn)樗鼈兣c較小顆?；旌隙坏凸懒耍^小顆粒的尺寸由于它們與較大顆粒的混合而被高估了，但是對于說明它們相對的分布情況仍然非常有用。純物質(zhì)的尺寸分布往往產(chǎn)生水平的半徑圖。
sec-mals/fld 聯(lián)合免疫熒光
通過將 sec 與免疫熒光 (if) 結(jié)合可以獲得更多的信息。這是通過使用熒光抗體偶聯(lián)物對樣品進(jìn)行預(yù)染色來檢測特定的囊泡標(biāo)記，然后用熒光檢測器讀取熒光信號來進(jìn)行的?？梢酝瑫r(shí)監(jiān)測 mals 和 uv 以提供更全面的表征。圖 3 代表了一次應(yīng)用，其中部分純化的樣品用 cd9-fitc 染色。cd9 染色標(biāo)示所有細(xì)胞外囊泡類型。mals 檢測所有囊泡類型。正如預(yù)期的那樣，熒光信號與 mals 非常吻合。約 23 分鐘處的另一個(gè)熒光峰對應(yīng)于未結(jié)合的抗體偶聯(lián)物，而約 28 分鐘處的第三個(gè)熒光峰對應(yīng)于游離熒光團(tuán)。
圖 4 展示了一系列 sec 色譜圖，這些色譜圖來自用 cd63-fitc 染色的部分純化樣品的陰離子交換餾分（aex 色譜圖未顯示）。在這種情況下，熒光峰明顯向 mals 峰的尾端洗脫?；叵胍幌?，圖 2 表明該區(qū)域由代表外泌體的較小囊泡組成。還要注意 mals 與峰間熒光比率的差異，第一個(gè)組分顯示最高的 cd63 與 mals 比率以及最高的 cd63 與 uv 比率。除了強(qiáng)調(diào)這種方法在一系列層析組分中能區(qū)分不同囊泡群的效用外，這些結(jié)果還表明了陰離子交換層析分離這些囊泡群的能力。
區(qū)分囊泡類型的免疫標(biāo)記物
不同的免疫標(biāo)記物可用于識別不同的囊泡類別，但目前還沒有任何一種標(biāo)記物可以支持明確的區(qū)分。因此，建議通過全凝膠蛋白質(zhì)印跡上至少三種不同的免疫學(xué)標(biāo)記來確認(rèn)外泌體的存在（圖 5）。全凝膠是必要的，以證明印跡條帶對應(yīng)的抗原是正確的分子量，并證明二抗不存在非特異性交叉反應(yīng)。sec-if 是對蛋白質(zhì)印跡法的補(bǔ)充，但它不能取代蛋白印跡法，因?yàn)榭乖匀慌c完整的外泌體結(jié)合，因此無法確認(rèn)其單個(gè)分子量。然而，使用 sec-if 可以防止二抗非特異性染色的潛在問題，而且它比蛋白質(zhì)印跡法快得多。三種不同的熒光抗體系列染色可以在不到兩小時(shí)完成，而不用花兩天的時(shí)間進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，并且自動進(jìn)樣器能夠以最少的勞動力實(shí)現(xiàn)高通量。
陰離子交換層析聯(lián)合mals
mals 還可與離子交換等梯度色譜法結(jié)合使用。圖 6 比較了細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物和部分純化外泌體的洗脫曲線。請注意，與部分純化樣品中更窄的分布相比，粗樣品中呈現(xiàn)囊泡的廣泛分布。這證實(shí)了圖 4 關(guān)于陰離子交換色譜實(shí)現(xiàn)囊泡分餾的能力。這并不意味著陰離子交換色譜必須根據(jù)囊泡大小或類型進(jìn)行分餾，但它確實(shí)突出了在線 mals 的實(shí)用性，它可以提供囊泡洗脫位置的定量指示而無需進(jìn)一步分析。這可以大大加快工藝開發(fā)。
實(shí)用分析工具
有可用的分析工具能夠允許及時(shí)檢測和表征目標(biāo)產(chǎn)品和主要污染物，是任何產(chǎn)品純化的重要先決條件。這對外泌體來說是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樗鼈儽旧聿⒉荒芡ㄟ^電泳或通過紫外吸光度監(jiān)測的色譜法產(chǎn)生清晰、區(qū)分良好的特征。蛋白免疫印跡分析但其速度慢、勞動密集和非定量的局限性嚴(yán)重加重了純化工藝開發(fā)和生產(chǎn)制造流程的負(fù)擔(dān)。
將 mals 與梯度色譜方法相結(jié)合，可以在色譜圖上直接顯示囊泡，并進(jìn)行定量檢測，無需額外的時(shí)間和勞動力。進(jìn)一步整合熒光增加了免疫學(xué)確認(rèn)以及 mals 的大小區(qū)分。即使使用 mals/if-sec 對分?jǐn)?shù)進(jìn)行二次評估，也可以比從蛋白印跡分析更快的獲得結(jié)果，并且它們是定量的。
這些新的分析工具，使得探索外泌體純化技術(shù)變得可行，這些技術(shù)比用于實(shí)現(xiàn)外泌體富集和宿主細(xì)胞污染物減少的基本方法有更高的能力。
在未來的推送中，
我們將繼續(xù)介紹：
●使用整體柱的可擴(kuò)展外泌體純化方案；用于管理dna 和非外泌體囊泡雜質(zhì)的可擴(kuò)展純化工具和技術(shù)。敬請期待！
本文來源：bia separations
一直以來，bia separations是具有質(zhì)粒dna、aav、mrna高效率純化。不僅提供整體柱及平臺方法，還提供定制的純化服務(wù)，以滿足質(zhì)粒dna、aav、mrna規(guī)?；a(chǎn)的純化需求。
陰離子交換色譜的效用也表明陽離子交換色譜應(yīng)該也是有用的。蛋白印跡分析表明一些外泌體結(jié)合而另一些則不結(jié)合（未顯示）。陰離子交換和陽離子交換結(jié)果均可通過系統(tǒng)修改柱平衡和洗脫條件進(jìn)行調(diào)整。疏水相互作用層析和其他梯度方法擴(kuò)展了選擇范圍。將這些方法中的任何一種與 mals 相結(jié)合，可以大大簡化為實(shí)現(xiàn)特定分離而進(jìn)行的發(fā)掘和優(yōu)化任務(wù)。
遺憾的是，if 不能與梯度色譜法聯(lián)合使用?？贵w和與其偶聯(lián)的熒光團(tuán)具有強(qiáng)電荷和疏水性特征。結(jié)合到囊泡表面后免疫偶聯(lián)物可以影響囊泡保留。在大多數(shù)情況下，這會導(dǎo)致標(biāo)記的囊泡在與抗體偶聯(lián)物相同的位置洗脫。只有尺寸排阻色譜（sec）支持if檢測，但這種情況下也不理想。
從邏輯上講，結(jié)合到囊泡外部會產(chǎn)生更大尺寸的復(fù)合物。因?yàn)槟遗葜饕诖笮^(qū)分為零的空隙體積中洗脫，所以效果是可以容忍的，至少對于使用小合成熒光團(tuán)的免疫偶聯(lián)物而言是這樣。使用大蛋白熒光團(tuán)如藻紅蛋白 (240 kda) 的偶聯(lián)物可能會掩蓋對于小熒光團(tuán)偶聯(lián)物來說會很明顯區(qū)分的囊泡大小的差異。