中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb 5009.22-2016
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品中黃曲霉毒素b族和g族的測定
前言
本標(biāo)準(zhǔn)代替gb/t 5009.22- 2003（食品中黃曲霉毒素b1的測定》、gb/t 5009.23-2006《食品中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2的測定》、gb 5009.24-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素m1和b1的測定》.gb/t 23212-20086牛奶和奶粉中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2、m1、m2的測定液相色譜-熒光檢測法》、gb/t 18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》、sn 0339-1995《出口茶葉中黃曲霉毒素b1檢驗(yàn)方法》、sn/t 1664-2005《牛奶和奶粉中黃曲霉毒素m1、b1、b2、g1、g2含量的測定》、sn/t 1101-2002《進(jìn)出口油籽及糧谷中黃曲霉毒素的檢驗(yàn)方法》、sn 0637-1997《出口油籽、堅(jiān)果及堅(jiān)果制品中黃曲霉毒素的檢驗(yàn)方法液相色譜法》、sn/t 1736-2006進(jìn)出口蜂蜜中黃曲霉毒素的檢驗(yàn)方法高效液相色譜法》、ny/t 1286-2007《花生黃曲霉毒素b1的測定高效液相色譜法》。
本標(biāo)準(zhǔn)與gb/t 5009.22-2003相比，主要變化如下：
——標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素b族和g族的測定”；
——根據(jù)gb 2761-2011的要求，增加了方法的適用范圍；
——增加了同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法為第一法；
——增加了高效液相色譜柱前衍生法為第二法：
——增加了高效液相色譜柱后衍生法為第三法：
——修改了酶聯(lián)免疫法，并將方法名稱更改為酶聯(lián)免疫吸附篩查法：
——增加了免疫親和柱以及酶聯(lián)免疫試劑盒質(zhì)量判定要求與方法；
——修改了測定組分為黃曲霉毒素b族和g族化合物。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2（以下簡稱aft b1、aft b2、aft g1和aft g2）的測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的測定。
本標(biāo)準(zhǔn)第二法為高效液相色譜-柱前衍生法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的測定。
本標(biāo)準(zhǔn)第三法為高效液相色譜-柱后衍生法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的測定。
本標(biāo)準(zhǔn)第四法為酶聯(lián)免疫吸附篩查法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中aft b1的測定。
本標(biāo)準(zhǔn)第五法為薄層色譜法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、味品中aft b1的測定。
第一法同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
2原理
試樣中的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液用含1%triton x-100（或吐溫-20）的磷酸鹽緩沖溶液稀釋后（必要時(shí)經(jīng)黃曲霉毒素固相凈化柱初步凈化），通過免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮、定容和過濾后經(jīng)液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。
3試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
3.1試劑
3.1.1乙腈（ch3cn）：色譜純。
3.1.2甲醇（ch3oh）：色譜純。
3.1.3乙酸銨（ch3 coonh4）：色譜純。
3.1.4氯化鈉（nacl）。
3.1.5磷酸氫二鈉（na2hpo4）。
3.1.6磷酸二氫鉀（kh2po4）。
3.1.7氯化（hua）鉀（kcl）。
3.1.8鹽酸（hcl）。
3.1.9 triton x-100[c14h22o（c2h4o）n]（或吐溫-20，c58h114o26）。
3.2試劑配制
3.2.1乙酸銨溶液（5 mmol/l）：稱取0.39 g乙酸銨，用水溶解后稀釋至1 000 ml，混勻。
3.2.2乙腈-水溶液（84+16）：取840 ml乙腈加入160 ml水，混勻。
3.2.3甲醇-水溶液（70+30）：取700 ml甲醇加入300 ml水，混勻。
3.2.4乙腈-水溶液（50+50）：取50 ml乙腈加入50 ml水，混勻。
3.2.5乙腈-甲醇溶液（50+50）：取50 ml乙腈加入50 ml甲醇，混勻。
3.2.6 10%鹽酸溶液：取1 ml鹽酸，用純水稀釋至10 ml，混勻。
3.2.7磷酸鹽緩沖溶液（以下簡稱pbs）：稱取8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉（或2.92 g十二水磷酸氫二鈉）、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化（hua）鉀，用900 ml水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.4±0.1，加水稀釋至1000ml。
3.2.8 1% triton x-100（或吐溫-20）的pbs：取10 ml triton x-100（或吐溫-20），用pbs稀釋至1 000 ml。
3.3標(biāo)準(zhǔn)品
3.3.1 aft b1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o6，cas：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.3.2 aft b2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o6，cas：7220-81-7）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.3.3 aft g1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o7，cas：1165-39-5）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.3.4 aft g2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o7，cas：7241-98-7）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.3.5同位素內(nèi)標(biāo)13c17-aft b1（c17h12o6，cas：1217449-45-0）：純度≥98%，濃度為0.5μg/ ml。
3.3.6同位素內(nèi)標(biāo)13c17-aft b2（c17h14o6，cas：1217470-98-8）：純度≥98%，濃度為0.5μg/ ml。
3.3.7同位素內(nèi)標(biāo)13c17-aft g1（c17h12o7，cas：1217444-07-9）：純度≥98%，濃度為0.5μg/ml。
3.3.8同位素內(nèi)標(biāo)13c17-aft g2（c17h14o7，cas：1217462-49-1）：純度≥98%，濃度為0.5μg/ml。
注：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以使用滿足溯源要求的商品化標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
3.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（10μg/ml）：分別稱取aft b1、aft b2、aft g1和aft g2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 ml。此溶液濃度約為10μg/ml。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后，在-20℃下避光保存，備用。臨用前進(jìn)行濃度校準(zhǔn)（校準(zhǔn)方法參見附錄a）。
3.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/ml）：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1.0μg/ml）1.00 ml至100 ml容量瓶中，乙腈定容。此溶液密封后避光-20℃下保存，三個月有效。
3.4.3混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液（100 ng/ml）：準(zhǔn)確移取0.5μg/ml13c17-aft b1、13c17-aft b2、13c17-aft g1和13c17-aft g2各2.00 ml，用乙腈定容至10 ml。在-20℃下避光保存，備用。
3.4.4標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/ml）10μl、50μl、100μl、200μl、500μl、800μl、1000μl至10ml容量瓶中，加入200μl 100ng/ml的同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動相定容至刻度，配制濃度點(diǎn)為0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、1.0 ng/ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、8.0 ng/ml、10.0 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4儀器和設(shè)備
4.1勻漿機(jī)。
4.2高速粉碎機(jī)。
4.3組織搗碎機(jī)。
4.4超聲波/渦旋振蕩器或搖床。
4.5天平：感量0.01 g和0.00001 g
4.6渦旋混合器。
4.7高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速6 500 r/ min~24 000 r/min。
4.8離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6 000 r/ min。
4.9玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm。
4.10固相萃取裝置（帶真空泵）。
4.11氮吹儀。
4.12液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：帶電噴霧離子源。
4.13液相色譜柱。
4.14免疫親和柱：aft b1柱容量≥200ng，aft b1柱回收率≥80%，aft g2的交叉反應(yīng)率≥80%（驗(yàn)證方法參見附錄b）。
注：對于不同批次的親和柱在使用前需進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證。
4.15黃曲霉毒素專用型固相萃取凈化柱或功能相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈ㄒ韵潞喎Q凈化柱）：對復(fù)雜基質(zhì)樣品測定時(shí)使用。
4.16微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜（所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無吸附現(xiàn)象，方可使用）。
4.17篩網(wǎng)：1 mm~2 mm試驗(yàn)篩孔徑。
4.18 ph計(jì)。
5分析步驟
使用不同廠商的免疫親和柱，在樣品上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能會略有不同，應(yīng)該按照供應(yīng)商所提供的操作說明書要求進(jìn)行操作。
警示：整個分析操作過程應(yīng)在指（zhi）定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域應(yīng)避光（直射陽光）、具備相對獨(dú)立的操作臺和廢棄物存放裝置。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，操作者應(yīng)按照接觸劇毒物的要求采取相應(yīng)的保護(hù)措施。
5.1樣品制備
5.1.1液體樣品（植物油、醬油、醋等）
采樣量需大于1 l，對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個包裝（同一批次或號），將所有液體樣品在一個容器中用勻漿機(jī)混勻后，其中任意的100 g（ml）樣品進(jìn)行檢測。
5.1.2固體樣品（谷物及其制品、堅(jiān)果及籽類、嬰幼兒谷類輔助食品等）
采樣量需大于1 kg，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過篩，使其粒徑小于2 mm孔徑試驗(yàn)篩，混合均勻后縮分至100 g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。
5.1.3半流體（腐乳、豆豉等）
采樣量需大于1 kg（l），對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個包裝（同一批次或號），用組織搗碎機(jī)搗碎混勻后，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。
5.2樣品提取
5.2.1液體樣品
5.2.1.1植物油脂
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入100μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液（3.4.3）振蕩混合后靜置30 min。加入20 ml乙腈-水溶液（84+ 16）或甲醇-水溶液（70+ 30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6000 r/min下離心10 min，取上清液備用。
5.2.1.2醬油、醋
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml.離心管中，加入125μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。用乙腈或甲醇定容至25 ml（精確至0.1 ml），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3min），在6000r/min下離心10min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。
5.2.2固體樣品
5.2.2.1一般固體樣品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml.離心管中，加入100μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。
5.2.2.2嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入100μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液（50+ 50）或甲醇-水溶液（70+ 30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。
5.2.3半流體樣品
稱取5 g試樣（精確至0.01g）于50 ml離心管中，加入100 pμl同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液（84+ 16）或甲醇-水溶液（70+30），置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。
5.3樣品凈化
5.3.1免疫親和柱凈化
5.3.1.1.上樣液的準(zhǔn)備
準(zhǔn)確移取4 ml上清液，加入46 ml 1% trition x-100（或吐溫-20）的pbs（使用甲醇-水溶液提取時(shí)可減半加入），混勻。
5.3.1.2免疫親和柱的準(zhǔn)備
將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。
5.3.1.3試樣的凈化
待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述樣液移至50 ml注射器簡中，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以1 ml/min~3 ml/min的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入2×10 ml水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統(tǒng)，在親和柱下部放置10 ml刻度試管，取下50 ml的注射器簡，加入2×1 ml甲醇洗脫親和柱，控制1 ml/min~3 ml/min的速度下滴，再用真空泵抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，加?.0 ml初始流動相，渦旋30 s溶解殘留物，0.22μm濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。
5.3.2黃曲霉毒素固相凈化柱和免疫親和柱同時(shí)使用（對花椒、胡椒和辣椒等復(fù)雜基質(zhì)）
5.3.2.1凈化柱凈化
移取適量上清液，按凈化柱操作說明進(jìn)行凈化，收集全部凈化液。
5.3.2.2免疫親和柱凈化
用刻度移液管準(zhǔn)確吸取上述凈化液4 ml，加入46 ml. 1% trtion x- 100（或吐溫-20）的pbs[使用甲醇-水溶液提取時(shí)，加入23ml 1% trition x-100（或吐溫-20）的pbs]，混勻。按5.3.1.2和5.3.1.3處理。
注：全自動（在線）或半自動（離線）的固相萃取儀器可優(yōu)化操作參數(shù)后使用。
5.4液相色譜參考條件
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動相：a相：5 mmol/l乙酸銨溶液；b相：乙腈-甲醇溶液（50+50）；
b）梯度洗脫：32% b（0 min~0.5 min），45% b（3 min~4 min），100% b（4.2 min~4.8 min），
32% b（5.0 min~7.0 min）；
c）色譜柱：c18柱（柱長100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm；填料粒徑1.7μm），或相當(dāng)者；
d）流速：0.3 ml/ min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣體積：10μl。
5.5質(zhì)譜參考條件
質(zhì)譜參考條件列出如下：
a）檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（mrm）；
b）離子源控制條件：參見表1；
c）離子選擇參數(shù)：參見表2；
d）子離子掃描圖：參見圖c.1~圖c.8；
e）液相色譜質(zhì)譜圖：見圖c.9。
5.6定性測定
試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。
每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍。
5.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
在5.4.5.5的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析條件下，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液由低到高濃度進(jìn)樣檢測，以aft b1、aft b2、aft g1和aft g2色譜峰與各對應(yīng)內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。
5.8試樣溶液的測定
取5.3處理得到的待測溶液進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算待測液中目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，按第6章計(jì)算樣品中待測物的含量。待測樣液中的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)適當(dāng)減少取樣量重新測定。
5.9空白試驗(yàn)
不稱取試樣，按5.2和5.3的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測組分的物質(zhì)。
6分析結(jié)果的表述
試樣中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的殘留量按式（1）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ——進(jìn)樣溶液中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2按照內(nèi)標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的濃
度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v1——試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位為毫升（ml）；
v3——樣品經(jīng)凈化洗脫后的最終定容體積，單位為毫升（ml）；
1000——換算系數(shù)；
v2——用于凈化分取的樣品體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣的稱樣量，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
7精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。
8其他
當(dāng)稱取樣品5 g時(shí)，aft b1的檢出限為：0.03μg/kg，aft b2的檢出限為0.03μg/kg，aft g1的檢出限為0.03μg/kg，aft g2的檢出限為0.03μg/kg；aft b1的定量限為0.1μg/kg，aft b2的定量限為0.1μg/kg，aft g1的定量限為0.1μg/kg，aft g2的定量限為0.1μg/kg。
第二法高效液相色譜-柱前衍生法
9原理
試樣中的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液經(jīng)黃曲霉毒素固相凈化柱凈化去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)，凈化液用三氟乙（yi）酸柱前衍生，液相色譜分離，熒光檢測器檢測外標(biāo)法定量。
10試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
10.1試劑
10.1.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
10.1.2乙睛（ch3cn）：色譜純。
10.1.3正己烷（c6h14）：色譜純。
10.1.4三氟乙（yi）酸（cf3cooh）。
10.2試劑配制
10.2.1乙腈-水溶液（84+16）：取840 ml乙腈加入160 ml水。
10.2.2甲醇-水溶液（70+30）：取700 ml甲醇加入300 ml水。
10.2.3乙腈-水溶液（50+50）：取500 ml乙腈加入500 ml水。
10.2.4乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 ml乙腈加入500 ml甲醇。
10.3標(biāo)準(zhǔn)品
10.3.1 aft b1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h2o6，cas號：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
10.3.2 aft b2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o6，cas號：7220-81-7）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
10.3.3 aft g1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o7，cas號：1165-39-5）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
10.3.4 aft g2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o7，cas號：7241-98-7）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
注：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以使用滿足溯源要求的商品化標(biāo)準(zhǔn)溶液。
10.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
10.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（10μg/ml）：分別稱取aft b1、aft b2、aft g1和aft g2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 ml。此溶液濃度約為10μg/ml。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后，在-20℃下避光保存，備用。臨用前進(jìn)行濃度校準(zhǔn)（校準(zhǔn)方法參見附錄a）。
10.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（aft b1和aft g1：100 ng/ml，aft b2和aft g2：30 ng/ml）：準(zhǔn)確移取aft b1和aft g1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各1 ml，aft b2和aft g2標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各300μl至100 ml容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20℃下保存，三個月內(nèi)有效。
10.4.3標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10μl、50μl、200μl、500μ、1000μl、2000μl、4000μl至10ml容量瓶中，用初始流動相定容至刻度（含aft b1和aft g1濃度為0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、10.0 ng/ml、20.0 ng/ml、40.0 ng/ml，aft b2和aft g2濃度為0.03 ng/ml、0.15 ng/ml、0.6 ng/ml、1.5 ng/ml、3.0 ng/ml、6.0 ng/ml、12 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液）。
11儀器和設(shè)備
11.1勻漿機(jī)。
11.2高速粉碎機(jī)。
11.3組織搗碎機(jī)。
11.4超聲波/渦旋振蕩器或搖床。
11.5天平：感量0.01 g和0.00001 g。
11.6渦旋混合器。
11.7高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速6 500 r/ min~24 000 r/min。
11.8離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6 000 r/ min。
11.9玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm。
11.10氮吹儀。
11.11液相色譜儀：配熒光檢測器。
11.12色譜分離柱。
11.13黃曲霉毒素專用型固相萃取凈化柱（以下簡稱凈化柱），或相當(dāng)者。
11.14一次性微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜（所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無吸附現(xiàn)象，方可使用）。
11.15篩網(wǎng)：1 mm~2 mm試驗(yàn)篩孔徑。
11.16恒溫箱。
11.17 ph計(jì)。
12分析步驟
12.1樣品制備
12.1.1液體樣品（植物油、醬油、醋等）
采樣量需大于1 l，對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個包裝（同一批次或號），將所有液體樣品在一個容器中用勻漿機(jī)混勻后，其中任意的100 g（ml）樣品進(jìn)行檢測。
12.1.2固體樣品（谷物及其制品、堅(jiān)果及籽類、嬰幼兒谷類輔助食品等）
采樣量需大于1 kg，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過篩.使其粒徑小于2 mm孔徑試驗(yàn)篩，混合均勻后縮分至100g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。
12.1.3半流體（腐乳、豆豉等）
采樣量需大于1 kg（l），對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個包裝（同一批次或號），用組織搗碎機(jī)搗碎混勻后，儲存于樣品瓶中密封保存，供檢測用。
12.2樣品提取
12.2.1液體樣品
12.2.1.1植物油脂
稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于50 ml.離心管中，加入20 ml乙腈-水溶液（84+ 16）或甲醇-水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min，取上清液備用。
12.2.1.2醬油、醋
稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，用乙腈或甲醇定容至25 ml（精確至0.1 ml），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3min），在6000r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。
12.2.2固體樣品
12.2.2.1一般固體樣品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入20.0 ml乙腈水溶液（84+16）或甲醇水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。
12.2.2.2嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入20.0 ml乙腈水溶液（50+50）或甲醇水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6000r/min下離心10min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。
12.2.3半流體樣品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入20.0 ml乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過濾），取上清液備用。
12.3樣品黃曲霉毒素固相凈化柱凈化
移取適量上清液，按凈化柱操作說明進(jìn)行凈化，收集全部凈化液。
12.4衍生
用移液管準(zhǔn)確吸取4.0 ml凈化液于10 ml離心管后在50℃下用氮?dú)饩従彽卮抵两?，分別加入200μl正己烷和100μl三氟乙（yi）酸，渦旋30 s，在40℃±1℃的恒溫箱中衍生15 min，衍生結(jié)束后，在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⒀苌捍抵两?，用初始流動相定容?.0 ml，渦旋30 s溶解殘留物，過0.22μm濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。
12.5色譜參考條件
色譜參考條件列出如下：
a）流動相：a相：水.b相：乙腈-甲醇溶液（50+ 50）；
b）梯度洗脫：24% b（0 min~6 min），35% b（8.0 min~ 10.0 min），100% b（10.2 min~11.2 min），24%b（11.5 min~13.0 min）；
c）色譜柱：c18柱（柱長150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5.0μm），或相當(dāng)者；
d）流速：1.0 ml/min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣體積：50μl；
g）檢測波長：激發(fā)波長360 nm；發(fā)射波長440 nm；
h）液相色譜圖：參見圖d.1。
12.6樣品測定
12.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。
12.6.2試樣溶液的測定
待測樣液中待測化合物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，濃度超過線性范圍的樣品則應(yīng)稀釋后重新進(jìn)樣分析。
12.6.3空白試驗(yàn)
不稱取試樣，按12.2.12.3和12.4的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測組分的物質(zhì)。
13分析結(jié)果的表述
試樣中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的殘留量按式（2）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ——進(jìn)樣溶液中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的濃
度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v1——試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位為毫升（ml）；
v3——凈化液的最終定容體積，單位為毫升（ml）；
1 000——換算系數(shù)；
v2——凈化柱凈化后的取樣液體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣的稱樣量，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
14精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。
15其他
當(dāng)稱取樣品5 g時(shí)，柱前衍生法的aft b1的檢出限為0.03μg/kg，aft b2的檢出限為0.03μg/kg，aft g1的檢出限為0.03μg/kg，aft g2的檢出限為0.03μg/ kg；柱前衍生法的aft b1的定量限為0.1μg/kg，aft b2的定量限為0.1μg/kg，aft g1的定量限為0.1μg/kg，aft g2的定量限為0.1μg/kg。
第三法高效液相色譜-柱后衍生法
導(dǎo)語：下述方法的儀器檢測部分，包括碘或溴試劑衍生、光化學(xué)衍生、電化學(xué)衍生等柱后衍生方法，可根據(jù)實(shí)際情況，選擇其中一種方法即可。
16原理
試樣中的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2，用乙腈水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮、定容和過濾后經(jīng)液相色譜分離，柱后衍生（碘或溴試劑衍生、光化學(xué)衍生、電化學(xué)衍生等），經(jīng)熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。
17試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
17.1試劑
17.1.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
17.1.2乙腈（ch3cn）：色譜純。
17.1.3氯化鈉（nacl）。
17.1.4磷酸氫二鈉（na2hpo4）。
17.1.5磷酸二氫鉀（kh2po4）。
17.1.6氯化（hua）鉀（kcl）。
17.1.7鹽酸（hcl）。
17.1.8 triton x- 100[c14h22o（c2h4o）n。]（或吐溫-20，c58h114o26）。
17.1.9碘衍生使用試劑：碘（i2）。
17.1.10溴衍生使用試劑：三溴化吡啶（c5h6br3n2）。
17.1.11電化學(xué)衍生使用試劑：溴化鉀（kbr）、濃硝酸（hno3）。
17.2試劑配制
17.2.1乙腈-水溶液（84+16）：取840 ml乙腈加入160 ml水。
17.2.2甲醇水溶液（70+30）：取700 ml甲醇加入300 ml水。
17.2.3乙腈-水溶液（50+50）：取500 ml乙腈加入500 ml水。
17.2.4乙腈-水溶液（10+90）：取100 ml乙腈加入900 ml水。
17.2.5乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500ml乙腈加入500ml甲醇。
17.2.6磷酸鹽緩沖溶液（以下簡稱pbs）：稱取8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉（或2.92 g十二水磷酸氫二鈉）、0.20g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化（hua）鉀，用900 ml水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.4，用水定容至1 000 ml。
17.2.7 1%triton x- 100（或吐溫20）的pbs：取10 ml triton x- 100，用pbs定容至1 000 ml。
17.2.8 0.05%碘溶液：稱取0.1 g碘，用20 ml甲醇溶解，加水定容至200 ml，用0.45μm的濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用（僅碘柱后衍生法使用）。
17.2.9 5 mg/l三溴化吡啶水溶液：稱取5 mg三溴化吡啶溶于1 l水中，用0.45μm的濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用（僅溴柱后衍生法使用）。
17.3標(biāo)準(zhǔn)品
17.3.1 aft b1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o6，cas號：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
17.3.2 aft b2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o6，cas號：7220-81-7）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
17.3.3 aft g1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o7，cas號：1165-39-5）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
17.3.4 aft g2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o7，cas號：7241-98-7）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
注：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以使用滿足溯源要求的商品化標(biāo)準(zhǔn)溶液。
17.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
17.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（10 1g/ml）：分別稱取aft b1、aft b2、aft g1和aft g2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 ml。此溶液濃度約為10μg/ml。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后，在-20℃下避光保存，備用。臨用前進(jìn)行濃度校準(zhǔn)（校準(zhǔn)方法參見附錄a）。
17.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（aft b1和aft g1：100 ng/ml、aft b2和aft g2：30 ng/ml）：準(zhǔn)確移取aft b1，和aft g1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各1 ml，aft b2和aft g2標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各300μl至100 ml容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20℃下保存，三個月內(nèi)有效。
17.4.3標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10μl、50μl、200μl、500μl、1 000μl、2000μl、4000μl至10ml容量瓶中，用初始流動相定容至刻度（含aft b1和aft g1濃度為0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、10.0 ng/ml、20.0 ng/ml、40.0 ng/ml，aft b2和aft g2濃度為0.03 ng/ml、0.15 ng/ml、0.6 ng/ml、1.5 ng/ml、3.0 ng/ml、6.0 ng/ml、12 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液）。
18儀器和設(shè)備
18.1勻漿機(jī)。
18.2高速粉碎機(jī)。
18.3組織搗碎機(jī)。
18.4超聲波/渦旋振蕩器或搖床。
18.5天平：感量0.01 g和0.00001 g。
18.6渦旋混合器。
18.7高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速6 500 r/min~24 000 r/ min。
18.8離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6 000 r/ min。
18.9玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留1.6 pm。
18.10固相萃取裝置（帶真空泵）。
18.11氮吹儀。
18.12液相色譜儀：配熒光檢測器（帶-般體積流動池或者大體積流通池）。
注：當(dāng)帶大體積流通池時(shí)不需要再使用任何型號或任何方式的柱后衍生器。
18.13液相色譜柱。
18.14光化學(xué)柱后衍生器（適用于光化學(xué)柱后衍生法）。
18.15溶劑柱后衍生裝置（適用于碘或溴試劑衍生法）。
18.16電化學(xué)柱后衍生器（適用于電化學(xué)柱后衍生法）。
18.17免疫親和柱：aft b1柱容量≥200 ng，aft b1柱回收率≥80%，aft g2的交叉反應(yīng)率≥80%（驗(yàn)證方法參見附錄b）。
注：對于每個批次的親和柱使用前需質(zhì)量驗(yàn)證。
18.18黃曲霉毒素固相凈化柱或功能相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈ㄒ韵潞喎Q凈化柱）：對復(fù)雜基質(zhì)樣品測定時(shí)使用。
18.19一次性微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜（所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無吸附現(xiàn)象，方可使用）。
18.20篩網(wǎng)：1 mm~2 mm試驗(yàn)篩孔徑。
19分析步驟
使用不同廠商的免疫親和柱，在樣品的上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同，應(yīng)該按照供應(yīng)商所提供的操作說明書要求進(jìn)行操作。
警示：整個分析操作過程應(yīng)在指（zhi）定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域應(yīng)避光（直射陽光）、具備相對獨(dú)立的操作臺和廢棄物存放裝置。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，操作者應(yīng)按照接觸劇毒物的要求采取相應(yīng)的保護(hù)措施。
19.1樣品制備
同12.1。
19.2樣品提取
同12.2。
19.3樣品凈化
19.3.1免疫親和柱凈化
19.3.1.1.上樣液的準(zhǔn)備
準(zhǔn)確移取4 ml上述上清液，加入46 ml 1% triton x- 100（或吐溫20）的pbs（使用甲醇水溶液提取時(shí)可減半加入），混勻。
19.3.1.2免疫親和柱的準(zhǔn)備
將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。
19.3.1.3試樣的凈化
免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后，將上述樣液移至50 ml注射器簡中，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以1 ml/min~3 ml/min的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入2×10 ml水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統(tǒng)，在親和柱下部放置10 ml刻度試管，取下50 ml的注射器筒，2×1 ml甲醇洗脫親和柱.控制1 ml/min~3 ml/min的速度下滴，再用真空泵抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑贸跏剂鲃酉喽ㄈ葜?.0 ml，渦旋30 s溶解殘留物，0.22μm濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。
19.3.2黃曲霉毒素固相凈化柱和免疫親和柱同時(shí)使用（對花椒、胡椒和辣椒等復(fù)雜基質(zhì)）
19.3.2.1凈化柱凈化
移取適量上清液，按凈化柱操作說明進(jìn)行凈化，收集全部凈化液。
19.3.2.2免疫親和柱凈化
用刻度移液管準(zhǔn)確吸取上部凈化液4 ml，加入46 ml 1% triton x- 100（或吐溫-20）的pbs（使用甲醇水溶液提取時(shí)可減半加入），混勻。按19.4.1.3處理。
注：全自動（在線）或半自動（離線）的固相萃取儀器可優(yōu)化操作參數(shù)后使用。
19.4液相色譜參考條件
19.4.1無衍生器法（大流通池直接檢測）
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動相：a相，水；b相，乙腈甲醇（50+50）；
b）等梯度洗脫條件：a，65%；b，35%；
c）色譜柱：c18柱（柱長100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，填料粒徑1.7μm），或相當(dāng)者；
d）流速：0.3 ml/min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣量：10μl；
g）激發(fā)波長：365 nm；發(fā)射波長：436 nm（aft b1、aft b2），463 nm（aft g1、aft g2）；
h）液相色譜圖見圖d.2。
19.4.2柱后光化學(xué)衍生法
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動相：a相，水；b相，乙腈-甲醇（50+50）；
b）等梯度洗脫條件：a，68%；b，32%；
c）色譜柱：c18柱（柱長150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5μm），或相當(dāng)者；
d）流速：1.0 ml/ min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣量：50μl；
g）光化學(xué)柱后衍生器；
h）激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm；
i）液相色譜圖見圖d.3。
19.4.3柱后碘或溴試劑衍生法
19.4.3.1柱后碘衍生法
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動相：a相，水；b相，乙腈-甲醇（50 +50）；
b）等梯度洗脫條件：a，68%；b，32%；
c）色譜柱：c18柱（柱長150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5μm），或相當(dāng)者；
d）流速：1.0 ml/ min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣量：50μl；
g）柱后衍生化系統(tǒng)；
h）衍生溶液：0.05%碘溶液；
i）衍生溶液流速：0.2 ml/min；
j）衍生反應(yīng)管溫度：70℃；
k）激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm；
l）液相色譜圖見圖d.4。
19.4.3.2柱后溴衍生法
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動相：a相，水；b相，乙腈-甲醇（50+50）；
b）等梯度洗脫條件：a，68%；b.32%；
c）色譜柱：c18柱（柱長150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5μm），或相當(dāng)者；
d）流速：1.0 ml/min；
e）色譜柱柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣量：50μl；
g）柱后衍生系統(tǒng)；
h）衍生溶液：5 mg/l三溴化吡啶水溶液；
i）衍生溶液流速：0.2 ml/ min；
j）衍生反應(yīng)管溫度：70℃；
k）激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm；
l）液相色譜圖見圖d.5。
19.4.4柱后電化學(xué)衍生法
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動相：a相，水（1 l水中含119 mg溴化鉀，350μl 4 mol/l硝酸）；b相，甲醇；
b）等梯度洗脫條件：a，60%；b，40%；
c）色譜柱：c18柱（柱長150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5μm），或相當(dāng)者；
d）柱溫：40℃；
e）流速：1.0 ml/min；
f）進(jìn)樣量：50μl；
g）電化學(xué)柱后衍生器：反應(yīng)池工作電流100μa；1根peek反應(yīng)管路（長度50 cm，內(nèi)徑0.5 mm）；
h）激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm；
i）液相色譜圖見圖d.6。
19.5樣品測定
19.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。
19.5.2試樣溶液的測定
待測樣液中待測化合物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，濃度超過線性范圍的樣品則應(yīng)稀釋后重新進(jìn)樣分析。
19.5.3空白試驗(yàn)
不稱取試樣，按19.3、19.4和19.5的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測組分的物質(zhì)。
20分析結(jié)果的表述
試樣中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的殘留量按式（3）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ——進(jìn)樣溶液中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v1——試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位為毫升（ml）；
v3——樣品經(jīng)免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，單位為毫升（ml）；
v2——用于免疫親和柱的分取樣品體積，單位為毫升（ml）；
1 000——換算系數(shù)；
m——試樣的稱樣量，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
21精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。
22其他
當(dāng)稱取樣品5 g時(shí)，柱后光化學(xué)衍生法、柱后溴衍生法、柱后碘衍生法、柱后電化學(xué)衍生法的aft b1的檢出限為0.03μg/kg，aft b2的檢出限為0.01μg/kg，aft g1的檢出限為0.03μg/kg，aft g2的檢出限為0.01μg/kg；無衍生器法的aft b1的檢出限為0.02μg/kg，aft b2的檢出限為0.003μg/kg、aft g1的檢出限為0.02μg/kg，aft g2的檢出限為0.003μg/kg；
柱后光化學(xué)衍生法、柱后溴衍生法、柱后碘衍生法、柱后電化學(xué)衍生法：aft b1的定量限為0.1μg/kg，aft b2的定量限為0.03μg/kg，aft g1的定量限為0.1μg/kg，aft g2的定量限為0.03μg/kg；無衍生器法：aft b1的定量限為0.05μg/kg，aft b2的定量限為0.01μg/kg，aft g1的定量限為0.05μg/kg，aft g2的定量限為0.01μg/kg。
第四法酶聯(lián)免疫吸附篩查法
23原理
試樣中的黃曲霉毒素b1用甲醇水溶液提取，經(jīng)均質(zhì)、渦旋、離心（過濾）等處理獲取上清液。被辣根過氧化物酶標(biāo)記或固定在反應(yīng)孔中的黃曲霉毒素b1，與試樣上清液或標(biāo)準(zhǔn)品中的黃曲霉毒素b1競爭性結(jié)合特異性抗體。在洗滌后加入相應(yīng)顯色劑顯色，經(jīng)無機(jī)酸終止反應(yīng)，于450 nm或630 nm波長下檢測。樣品中的黃曲霉毒素b1與吸光度在一定濃度范圍內(nèi)呈反比。
24試劑和材料
配制溶液所需試劑均為分析純，水為gb/t6682規(guī)定二級水。
按照試劑：盒說明書所述.配制所需溶液。
所用商品化的試劑盒需按照e中所述方法驗(yàn)證合格后方可使用。
25儀器和設(shè)備
25.1微孔板酶標(biāo)儀：帶450 nm與630 nm（可選）濾光片。
25.2研磨機(jī)。
25.3振蕩器。
25.4電子天平：感量0.01 g。
25.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6000 r/ min.
25.6快速定量濾紙：孔徑11μm。
25.7篩網(wǎng)：1 mm~2 mm孔徑。
25.8試劑盒所要求的儀器。
26分析步驟
26.1樣品前處理
26.1.1液態(tài)樣品（油脂和調(diào)味品）
取100g待測樣品搖勻，稱取5.0g樣品于50 ml離心管中，加入試劑盒所要求提取液，按照試紙盒說明書所述方法進(jìn)行檢測。
26.1.2固態(tài)樣品（谷物、堅(jiān)果和特殊膳食用食品
稱取至少100 g樣品，用研磨機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后的樣品過1 mm~2 mm孔徑試驗(yàn)篩。取5.0g樣品于50ml離心管中，加入試劑盒所要求提取液，按照試紙盒說明書所述方法進(jìn)行檢測。
26.2樣品檢測
按照酶聯(lián)免疫試劑盒所述操作步驟對待測試樣（液）進(jìn)行定量檢測。
27分析結(jié)果的表述
27.1酶聯(lián)免疫試劑盒定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制
按照試劑盒說明書提供的計(jì)算方法或者計(jì)算機(jī)軟件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度變化關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
27.2待測液濃度計(jì)算
按照試劑盒說明書提供的計(jì)算方法以及計(jì)算機(jī)軟件，將待測液吸光度代入27.1所獲得公式，計(jì)算得待測液濃度（ρ）。
27.3結(jié)果計(jì)算
食品中黃曲霉毒素b1的含量按式（4）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ——待測液中黃曲霉毒素b1的濃度，單位為微克每升（μg/l）；
v——提取液體積（固態(tài)樣品為加入提取液體積，液態(tài)樣品為樣品和提取液總體積），單位為升（l）；
f——在前處理過程中的稀釋倍數(shù)；
m——試樣的稱樣量，單位為千克（kg）。
計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。
陽性樣品需用第一法、第二法或第三法進(jìn)一步確認(rèn)。
28精密度
每個試樣稱取兩份進(jìn)行平行測定，以其算術(shù)平均值為分析結(jié)果。
其分析結(jié)果的相對相差應(yīng)不大于20%。
29其他
當(dāng)稱取谷物、堅(jiān)果、油脂、調(diào)味品等樣品5 g時(shí)，方法檢出限為1μg/kg，定量限為3μg/kg。
當(dāng)稱取特殊膳食用食品樣品5g時(shí)，方法檢出限為0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg。
第五法薄層色譜法
30原理
樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，黃曲霉毒素b1在紫外光（波長365 nm）下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最（zui）低檢出量來測定含量。
31試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t6682規(guī)定的一級水。
31.1試劑
31.1.1甲醇（ch3oh）。
31.1.2正己烷（c6h14）。
31.1.3石油醚（沸程30℃~60℃或60℃~90℃）。
31.1.4三氯（lv）甲烷（chcl3）。
31.1.5苯（c6h6）。
31.1.6乙腈（ch3cn）。
31.1.7無水乙（yi）醚（c2h6o）。
31.1.8丙酮（c3h6o）。
注：以上試劑在試驗(yàn)時(shí)先進(jìn)行一次試劑空白試驗(yàn)，如不干擾測定即可使用，否則需逐一進(jìn)行重蒸。
31.1.9硅膠g：薄層層析用。
31.1.10三氟乙（yi）酸（cf3cooh）。
31.1.11無水硫酸鈉（na2so4）。
31.1.12氯化鈉（nacl）。
31.2試劑配制
31.2.1苯-乙腈溶液（98+2）：取2 ml乙腈加入98 ml苯中混勻。
31.2.2甲醇水溶液（55+45）：取550 ml甲醇加入450 ml水中混勻。
31.2.3甲醇-三氯（lv）甲烷（4+96）：取4 ml甲醇加入96 ml三氯（lv）甲烷中混勻。
31.2.4丙酮-三氯（lv）甲烷（8+92）：取8 ml丙酮加入92 ml三氯（lv）甲烷中混勻。
31.2.5次氯酸鈉溶液（消毒用）：取100 g漂白粉，加入500 ml水，攪拌均勻。另將80 g工業(yè)用碳酸鈉（na2co3·10h2o）溶于500 ml溫水中，再將兩液混合、攪拌，澄清后過濾。此濾液含次氯酸濃度約為25g/l。若用漂粉精制備，則碳酸鈉的量可以加倍。所得溶液的濃度約為50g/l。污染的玻璃儀器用10g/l氯酸鈉溶液浸泡半天或用50g/l次氯酸鈉溶液浸泡片刻后，即可達(dá)到去毒效果。
31.3標(biāo)準(zhǔn)品
aft b1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o6，cas號：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
31.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
31.4.1 aft b1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（10 rg/ml）：準(zhǔn)確稱取1 mg~1.2 mg aft b1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2 ml乙腈溶解后，再用苯稀釋至100 ml，避光，置于4℃冰箱保存，此溶液濃度約10μg/ml。
純度的測定：取5μl 10μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)溶液.滴加于涂層厚度0.25 mm的硅膠g薄層板上，用甲醇-三氯（lv）甲烷與丙酮-三氯（lv）甲烷展開劑展開，在紫外光燈下觀察熒光的產(chǎn)生，應(yīng)符合以下條件：
a）在展開后，只有單一的熒光點(diǎn)，無其他雜質(zhì)熒光點(diǎn)；
b）原點(diǎn)上沒有任何殘留的熒光物質(zhì)。
31.4.2 aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取1 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液于10 ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混勻。此溶液每毫升相當(dāng)于1.0μg aft b1。吸取1.0 ml此稀釋液，置于5 ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度.此溶液每毫升相當(dāng)于0.2μg aft b1。再吸取aft b1標(biāo)準(zhǔn)榕液（0.2μg/ml）1.0ml置于5 ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于0.04μg aft b1。
32儀器和設(shè)備
32.1圓孔篩：2.0 mm篩孔孔徑。
32.2小型粉碎機(jī)。
32.3電動振蕩器。
32.4全玻璃濃縮器。
32.5玻璃板：5 cm×20 cm。
32.6薄層板涂布器。
注：可選購適用黃曲霉毒素檢測的商品化薄層板。
32.7展開槽：長25 cm，寬6 cm，高4 cm。
32.8紫外光燈：100 w~125 w，帶365 nm濾光片。
32.9微量注射器或血色素吸管。
33分析步驟
警示：整個操作需在暗室條件下進(jìn)行。
33.1樣品提取
33.1.1玉米、大米、小麥、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等
33.1.1.1甲法：稱取20.00 g粉碎過篩試樣（面粉、花生醬不需粉碎），置于250 ml具塞錐形瓶中，加30 ml正己烷或石油醚和100 ml甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴(yán)防漏。振蕩30 min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，待下層甲醇水帶被分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶內(nèi)。取20.00 ml甲醇水溶液（相當(dāng)于4g試樣）置于另一125 ml分液漏斗中，加20 ml三氯（lv）甲烷，振搖2 min，靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層。放出三氯（lv）甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯（lv）甲烷濕潤的無水硫酸鈉的定量慢速濾紙過濾于50ml蒸發(fā)皿中，再加5ml三氯（lv）甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯（lv）甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯（lv）甲烷洗過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)血放在通風(fēng)柜于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在冰盒上冷卻2 min~3 min后，準(zhǔn)確加入1 ml苯-乙腈混合液（或?qū)⑷龋╨v）甲烷用濃縮蒸餾器減壓吹氣蒸干后，準(zhǔn)確加入1 ml苯-乙腈混合液）。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌?，若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2 ml具塞試管中。
33.1.1.2乙法（限于玉米、大米、小麥及其制品）：稱取20.00 g粉碎過篩試樣于250 ml具塞錐形瓶中，用滴管滴加約6 ml水，使試樣濕潤，準(zhǔn)確加入60 ml三氯（lv）甲烷，振蕩30 min，加12 g無水硫酸鈉，振搖后，靜置30 min，用疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于100 ml具塞錐形瓶中。取12 ml濾液（相當(dāng)4 g試樣）于蒸發(fā)皿中，在65℃水浴鍋上通風(fēng)揮干，準(zhǔn)確加入1 ml苯-乙腈混合液，以下按33.1.1.1自“用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只?.....”起依法操作。
33.1.2花生油、香油、菜油等
稱取4.00g試樣置于小燒杯中，用20 ml正己烷或石油醚將試樣移于125 ml分液漏斗中。用20 ml甲醇水溶液分次洗燒杯，洗液一并移入分液漏斗中，振搖2 min，靜置分層后，將下層甲醇水溶液移入第二個分液漏斗中，再用5 ml甲醇水溶液重復(fù)振搖提取一次，提取液一并移入第二個分液漏斗中，在第二個分液漏斗中加入20 ml三氯（lv）甲烷，以下按33.1.1.1自“振搖2 min，靜置分層......”起依法操作。
33.1.3醬油、醋
稱取10.00g試樣于小燒杯中，為防止提取時(shí)乳化，加0.4 g氯化鈉，移入分液漏斗中，用15 ml三氯（lv）甲烷分次洗滌燒杯，洗液一并移入分液漏斗中。以下按33.1.1.1自“振搖2 min，靜置分層......”起依法操作，最后加入2.5 ml苯-乙腈混合液，此溶液每毫升相當(dāng)于4 g試樣。
或稱取10.00 g試樣，置于分液漏斗中，再加12 ml甲醇（以醬油體積代替水，故甲醇與水的體積比仍約為55：45），用20 ml三氯（lv）甲烷提取，以下按33.1.1.1自“振搖2 min，靜置分層......”起依法操作。最后加入2.5 ml苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相當(dāng)于4 g試樣。
33.1.4干醬類（包括豆豉、腐乳制品）
稱取20.00 g研磨均勻的試樣，置于250 ml具塞錐形瓶中，加入20 ml正己烷或石油醚與50 ml甲醇水溶液。振蕩30 min，靜置片刻，以疊成折疊式快速定性濾紙過濾，濾液靜置分層后，取24 ml甲醇水層（相當(dāng)8 g試樣，其中包括8 g干醬類本身約含有4 ml水的體積在內(nèi)）置于分液漏斗中，加入20 ml三氯（lv）甲烷，以下按33.1.1.1自“振搖2 min，靜置分層......”起依法操作。最后加入2 ml苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相當(dāng)于4 g試樣。
33.2測定
33.2.1單向展開法
33.2.1.1薄層板的制備
稱取約3 g硅膠g，加相當(dāng)于硅膠量2倍~3倍的水，用力研磨1 min~2 min至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi)，推成5 cm×20 cm，厚度約0.25 mm的薄層板三塊。在空氣中干燥約15 min后，在100℃活化2 h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2 d~3 d，若放置時(shí)間較長，可再活化后使用。
33.2.1.2點(diǎn)樣
將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為1 cm，點(diǎn)直徑約3 mm。在同一塊板上滴加點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吹邊加。滴加樣式如下：
第一點(diǎn)：0μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.04μg/ ml）。
第二點(diǎn)：20μl樣液。
第三點(diǎn)：20μl樣液+10μl 0.04μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液。
第四點(diǎn)：20μl樣液十10μl 0.2μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液。
33.2.1.3展開與觀察
在展開槽內(nèi)加10 ml無水乙（yi）醚，預(yù)展12 cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10 ml丙酮-三氯（lv）甲烷（8+92），展開10 cm~12 cm，取出。在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下。
由于樣液點(diǎn)上加滴aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液，可使aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液中的aft b1熒光點(diǎn)重疊。如樣液為陰性，薄層板上的第三點(diǎn)中aft b1為0.0004μg，可用作檢查在樣液內(nèi)aft b1，最（zui）低檢出量是否正常出現(xiàn)：如為陽性，則起定性作用。薄層板上的第四點(diǎn)中aft b1為0.002μg，主要起定位作用。
若第二點(diǎn)在與aft b1，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，表示試樣中aft b1含量在5μg/kg以下，如在相應(yīng)位置上有藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，則需進(jìn)行確證試驗(yàn)。
33.2.1.4確證試驗(yàn)
為了證實(shí)薄層板上樣液熒光系由aft b1產(chǎn)生的，加滴三氟乙（yi）酸，產(chǎn)生aft b1的衍生物，展開后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個點(diǎn)。
第一點(diǎn)：0.04μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液10μl。
第二點(diǎn)：20μl樣液。于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙（yi）酸蓋于其上，反應(yīng)5 min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2 min后，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃，再于薄層板上滴加以下兩個點(diǎn)。
第三點(diǎn)：0.04μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液10μl。
第四點(diǎn)：20μl樣液。
再展開（同16.2.1.3），在紫外光燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙（yi）酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對照。
33.2.1.5稀釋定量
樣液中的aft b1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度如與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最（zui）低檢出量（0.0004μg）的熒光強(qiáng)度一致，則試樣中aft b1含量即為5μg/kg。如樣液中熒光強(qiáng)度比最（zui）低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最（zui）低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。滴加式樣如下：
第一點(diǎn)：10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.04μg/ml）
第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10μl樣液。
第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15μl樣液。
第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20μl樣液。
33.2.1.6結(jié)果計(jì)算
試樣中aft b1的含量按式（5）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
0.000 4——aft b1的最（zui）低檢出量，單位為微克（g）；
v1——加入苯-乙腈混合液的體積，單位為毫升（ml）；
f——樣液的總稀釋倍數(shù)；
v2——出現(xiàn)最（zui）低熒光時(shí)滴加樣液的體積，單位為毫升（ml）；
m——加入苯-乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
1 000——換算系數(shù)。
結(jié)果表示到測定值的整數(shù)位。
33.2.2雙向展開法
如用單向展開法展開后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了aft b1的熒光強(qiáng)度，需采用雙向展開法。薄層板先用無水乙（yi）醚作橫向展開，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)的一邊而aft b1不動，然后再用丙酮-三氯（lv）甲烷（8+92）作縱向展開，試樣在aft b1相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法靈敏度。如用雙向展開中滴加兩點(diǎn)法展開仍有雜質(zhì)干擾時(shí)，則可改用滴加一點(diǎn)法。
33.2.2.1滴如兩點(diǎn)法
33.2.2.1.1點(diǎn)樣
取薄層板三塊，在距下端3 cm基線上滴加aft b1，標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板的距左邊緣0.8 cm~1 cm處各滴加10 l aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml），在距左邊緣2.8 cm~3 cm處各滴加20μl樣液，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml），在第三塊板的樣液點(diǎn)上加滴10μl 0.2μ/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液。
33.2.2.1.2展開
33.2.2.1.2.1橫向展開：在展開槽內(nèi)的長邊置一玻璃支架，加10 ml無水乙醇，將上述點(diǎn)好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長邊置于展開槽內(nèi)展開，展至板端后，取出揮干，或根據(jù)情況需要時(shí)可再重復(fù)展開1次~2次。
33.2.2.1.2.2縱向展開：揮干的薄層板以丙酮-三氯（lv）甲烷（8+92）展開至10 cm~12 cm為止。丙酮與三氯（lv）甲烷的比例根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。
33.2.2.1.3觀察及評定結(jié)果
在紫外光燈下觀察第一、二板，若第二板的第二點(diǎn)在aft b1，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最（zui）低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則試樣中aft b1含量在5μg/kg以下。
若第一板在與第二板的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上第二點(diǎn)與第一板上第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。在具體測定中，第一、二、三板可以同時(shí)做，也可按照順序做。如按順序做，當(dāng)在第一板出現(xiàn)陰性時(shí)，第三板可以省略，如第一板為陽性，則第二板可以省略，直接作第三板。
33.2.2.1.4確證試驗(yàn)
另取薄層板兩塊，于第四、第五兩板距左邊緣0.8 cm~1 cm處各滴加10μl aft b1，標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml）及1小滴三氟乙（yi）酸；在距左邊緣2.8 cm~3 cm處，于第四板滴加20μl樣液及1小滴三氟乙（yi）酸，于第五板滴加20μl樣液、10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml）及1小滴三氟乙（yi）酸。反應(yīng)5 min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2 min，使熱風(fēng)吹到薄層極上的溫度不高于40℃。再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物。觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。如樣液aft b1含量高時(shí)，則將樣液稀釋后，按33.2.1.4做確證試驗(yàn)。
33.2.2.1.5稀釋定量
如樣液aft b1含量高時(shí)，按16.3.1.5稀釋定量操作。如aft b1含量低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果的判斷，可將樣液再做雙向展開法測定，以確定含量。
33.2.2.1.6結(jié)果計(jì)算
同33.2.1.6。
33.2.2.2滴加一點(diǎn)法
33.2.2.2.1點(diǎn)樣
取薄層板三塊，在距下端3 cm基線上滴加aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板臣左邊緣0.8cm~1 cm處各滴加20μl樣液，在第二板的點(diǎn)上加10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml）。在第三板的點(diǎn)上加滴10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)榕液（0.2μg /ml）。
33.2.2.2.2展開
同33.2.2.1.2的橫向展開與縱向展開。
33.2.2.2.3觀察及評定結(jié)果
在紫外光燈下觀察第一、二板，如第二板出現(xiàn)最（zui）低檢出量的黃曲霉霉素b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，而第一板與其相同位置上來出現(xiàn)熒光點(diǎn)，試樣中aft b1含量在5μg/kg以下。如第一板在與第二板aft b1相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上與第一板相同位置的熒光點(diǎn)是否與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊再進(jìn)行以下確證試驗(yàn)。
33.2.2.2.4確證試驗(yàn)
另取兩板，于距左邊緣0.8 cm~1 cm處，第四板滴加20μl樣液、1滴三氟乙（yi）酸；第五板滴加20μl樣液、10μl 0.04μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液及1滴三氟乙（yi）酸。產(chǎn)生衍生物及展開方法同33.2.2.1。再將以上二板在紫外光燈下觀察，以確定樣液點(diǎn)是否產(chǎn)生與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物，觀察時(shí)可將第一板作為樣液的衍生物空白板。經(jīng)過以上確證試驗(yàn)定為陽性后，再進(jìn)行稀釋定量，如含aft b1低，不需稀釋或稀釋倍數(shù)小，雜質(zhì)熒光仍有嚴(yán)重干擾，可根據(jù)樣液中黃曲霉毒素b1熒光的強(qiáng)弱，直接用雙向展開法定量。
33.2.2.2.5結(jié)果計(jì)算
同33.2.1.6。
34精密度
每個試樣稱取兩份進(jìn)行平行測定，以其算術(shù)平均值為分析結(jié)果。
其分析結(jié)果的相對相差應(yīng)不大于60%。
35其他
薄層板上黃曲霉毒素b1的最（zui）低檢出量為0.000 4μg，檢出限為5μg/kg。