一、取樣準備
（1）取樣時該樣品必須是代表該批產(chǎn)品情況。
從車間取回樣品冷凍品按要求進行解凍，干燥食品可放在常溫冷暗處，易腐和冷卻樣品應放入10℃環(huán)境。冷凍樣品來不及檢驗應放入-15℃以下冰箱內(nèi)，待檢樣品存放時間不應超過36h。
（2）解凍
原則上冷凍樣品取出后，按包裝原樣在室溫下自然解凍；也可在0-4℃環(huán)境解凍，時間不超過18小時；也可在溫度不超過45℃環(huán)境中解凍，時間不超過15min。如果這些解凍條件對有些產(chǎn)品尤其是大塊冷凍品達不到解凍的目的，可參照以下解凍時間。
① 100-300g調理食品45℃解凍10min左右；
② 500g以下冷凍蔬菜30℃解凍40min左右；
③ 500g以上冷凍樣品37℃解凍1h左右；室溫下解凍2h左右。
※ 備注：將樣品解凍到半解凍狀態(tài)（用剪刀能剪開的程度）。
（3）操作環(huán)境
試驗前用臭氧發(fā)生器/紫外線將工器具、無菌間滅菌消毒，達到無菌狀態(tài)。
操作試驗的準備物品均質袋、酒精及酒精棉、吸管、平皿、稀釋液、剪刀、鑷子、無菌盆等物品是否齊全。
二、取樣及樣液制備
1 樣品標識
將樣品從污染程度低到污染程度高的順序排列，相應的作一一對應性標識，其中按細菌數(shù)平皿、大腸菌群平皿、平皿的順序，2-3個樣品一摞。
2 檢樣采取
先將樣品外包裝正反面用酒精噴灑（如果樣品表面有冷凝水先擦拭干凈后再用酒精噴灑）
（1）固體樣品
① 75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀剪開
② 在電子稱上放入無菌均質袋（手不要碰及袋口）去皮調整至零，
③ 用火焰滅菌后的剪刀和鑷子取樣，稱取25g有代表性樣品
④ 加入225ml滅菌磷酸鹽緩沖液（開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌）后，均質或待均質
⑤擦拭干凈剪刀鑷子后浸泡于75%酒精容器中并將樣品封口。
⑥將袋子折疊后用拍擊式均質器均質約30秒作為樣液，此時均質袋內(nèi)要設定為不含空氣（可根據(jù)樣品不同情況相應調整均質時間），
（2）液體樣品
①冷凍樣品解凍后使用。
②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，用滅菌吸管取充分混合后樣25ml。
③余同上。
(3) 粉末狀樣品以及半固體樣品
①將樣品混合均一化。
②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，以無菌匙采取混合后樣10g。
③加入90ml滅菌磷酸鹽緩沖液，開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌。
④余同上。
※備注：
（1） 從罐頭取樣時，在表面放上小塊酒精棉（倒上少量酒精）點火燃燒后開罐。罐頭起子用酒精棉擦拭火焰滅菌后使用。
（2） 75%酒精必須保證一周換3次，如果容器內(nèi)有明顯的污物應立即更換。
（3） 火焰滅菌的剪刀、鑷子通過火焰4-5s即可。
三、稀釋方法
①從均質袋準確吸取樣液1ml，
②沿管壁徐徐接種到含9ml磷酸鹽緩沖液里，蓋上試管塞后充分震蕩混勻為1：100稀釋液。（勿使吸管伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。）
③重復該操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀釋液。
④為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞增稀釋時（原液在前稀釋液在后），每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應更換一支吸管。
⑤不要在稀釋劑中吹洗吸管。
※備注：
（1） 樣液稀釋必須加以足夠震搖，確保液體混勻，形成的菌落能以10倍遞增或遞減，符合邏輯性。
（2） 車間產(chǎn)品根據(jù)加工工藝或對污染情況的估計選擇合適的稀釋倍。（尤其注意蔥、姜、蒜等無加熱類產(chǎn)品、保存實驗、外調新廠家、樣品開發(fā)、原料等樣品）。
四、樣液接種方法：
① 從吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同時在吸管尾端插上吸耳球后，從吸管尾端至快速通過火焰，并且排空吸管里殘留的水，
② 以吸管插入均質袋樣液內(nèi)的深度不超過2.5cm處，準確吸取樣品勻液（吸管尖不要碰著袋口。吸入的液體應先高于所要求的刻度, 然后提起吸管使其離開液面并貼在袋內(nèi)將液體調至所要求的刻度。）1ml、1ml、1ml、0.2ml無菌操作分別以2～4s內(nèi)注入已標識清楚的細菌數(shù)、大腸菌群、ec以及平皿中（ec接種后應迅速震蕩均勻）
③ 如果某一樣品液在接種前放置時間超過3 min，應重新均質。
④為了驗證稀釋液、培養(yǎng)基、平皿、吸管等器具無菌需做空白對照。
五、傾注倒藥方法
右手持培養(yǎng)基三角瓶（已放50-60℃的水浴中恒溫）置火焰旁邊，用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上；也可將平皿放在火焰附近的桌面上用左手的拇指和食指打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻
※備注：
（1）培養(yǎng)基在50-60℃水浴中的保溫時間不要超過4h。
（2）從采樣開始到分注培養(yǎng)基操作限于20min以內(nèi)。
（3）涂布的平皿表面需干燥（干燥不充分易發(fā)生菌落擴散，有冷凝水不利于細菌分離并且會導致細菌繁殖使結果失真；干燥過分，會導致培養(yǎng)基裂開，不能用；干燥合適，則樣液吸收、快）。
（4）細菌容易吸附在玻璃器皿的表面，所以菌液注入平皿后應盡快將平皿內(nèi)的樣液和瓊脂培養(yǎng)基充分混合，否則細菌不容易分散?；旌戏椒ㄊ菍⑵矫髢A斜和旋轉使之充分混合，但要注意不要讓培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿內(nèi)溢出，且不要粘附在平皿壁和蓋上。
六、培養(yǎng)
●平皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中(每垛最多堆放6個平皿，平皿間要留有空隙進行空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達到一致)，按所規(guī)定的時間溫度進行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱應保持一定的濕度,經(jīng)48h培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基的失重不得超過15％
●斜面、高層斜面、液體培養(yǎng)基立在試管架上放入恒溫培養(yǎng)箱中，按所規(guī)定的時間溫度進行培養(yǎng)
七、計數(shù)判定及注意事項
●由于細菌種類繁多，差別甚大。計數(shù)時一般用透射光于平皿背面或正面（菌落計數(shù)器）仔細觀察。必要時用放大鏡檢查，以防遺漏尤其是平皿邊緣生長的菌落。
●計數(shù)方法參照sn/t 0168-2015方法。
●稀釋度低的培養(yǎng)皿，微生物菌落和食品碎渣很難區(qū)分，一般以食品碎渣沒有光澤，不夠光滑來識別。
●為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計數(shù)時作對照觀察。
●必要時，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在平板計數(shù)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑ttc（100ml加入1ml 0.5%ttc），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。
●在發(fā)酵試驗中，發(fā)酵倒管的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡，或發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡，都應作進一步試驗。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的發(fā)酵有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳氣泡一樣，即應考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應作進一步試驗。如果只是搖起的氣泡，就是陰性。
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