故障排除以下故障排除指南旨在解釋免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫熒光 (icc/if) 染色中觀察到的常見問題的原因和可能的解決方案。
沒信號(hào)
抗體應(yīng)用
增加一抗或二抗的濃度或孵育時(shí)間。
透化緩沖液
使用適當(dāng)?shù)耐富噭┻M(jìn)行靶蛋白的定位。 triton 去污劑對(duì)于線粒體或核蛋白是必需的，但會(huì)溶解外膜并破壞正確的膜定位。
增加孵育時(shí)間或洗滌劑濃度。
細(xì)胞固定
過度固定可能會(huì)導(dǎo)致表位掩蔽。減少固定劑的時(shí)間或濃度。
抗體相容性
通過檢查物種反應(yīng)性來確認(rèn)您的一抗和二抗是否兼容。
確認(rèn)抗體可用于蛋白質(zhì)處于天然構(gòu)象的測(cè)定。
通過使用陽性對(duì)照初級(jí)濾光片，確保次級(jí)濾光片正常工作并與顯微鏡的濾光片組兼容。
目標(biāo)可用性
使用已知表達(dá)目的蛋白的過表達(dá)測(cè)定或陽性對(duì)照細(xì)胞系。
細(xì)胞干燥
如果細(xì)胞干燥，熒光信號(hào)將會(huì)丟失。環(huán)蓋玻片涂有指甲油。
細(xì)胞活力
在開始染色程序之前確認(rèn)細(xì)胞活力。
顯微鏡調(diào)整
增加相機(jī)的曝光時(shí)間。
背景
抗體濃度
降低一抗/二抗的濃度。
阻塞
增加封閉緩沖液中的孵育時(shí)間或血清濃度。使用封閉緩沖液稀釋一抗和二抗。
抗體應(yīng)用
始終將一抗在 4° c 下孵育過夜。室溫孵育會(huì)增加非特異性結(jié)合并導(dǎo)致更高的背景。
通過在沒有初級(jí)的情況下進(jìn)行測(cè)定，確認(rèn)次級(jí)不會(huì)與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。
污染文物
確保載玻片清潔且無灰塵。緩沖液應(yīng)新鮮配制，以防止微生物污染。
洗滌
增加洗滌次數(shù)。對(duì)板進(jìn)行非常溫和的攪拌。
增加 pbs-t 中 tween 的濃度。
光譜重疊
如果對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重或三重標(biāo)記，請(qǐng)確認(rèn)二級(jí)細(xì)胞不會(huì)重疊到相同的光譜范圍內(nèi)