人類嗜t淋巴細胞病毒1型探針法熒光定量rt-pcr試劑盒產(chǎn)品及特點
人類嗜 t 淋巴細胞病毒 1 型（human t-lymphotropic virus 1 htlv 1）是一種感染后可導(dǎo)致血癌或其他轉(zhuǎn)移癌的 rna 病毒，在體內(nèi)主要感染 cd4+t淋巴細胞可引起成人 t 淋巴細胞白血病/淋巴瘤、htlv 相關(guān)脊髓病（htlv-iassociated myelopathy ， ham/ 熱帶痙攣性下肢癱， tropical spasticparaparesis tsp）及色素層炎（uveitis），主要通過輸血、針頭、性行為、母子傳染。htlv-i 病毒是愛滋病毒（htlv-i) 的遠親，但 htlv-i 和愛滋病的發(fā)生沒有任何關(guān)連。目前各捐血中心以酵素免疫法全面篩檢 htlv-i 病毒。
本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 pcr 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的人類嗜 t 淋巴細胞病毒 1 型探針法熒光定量 rt-pcr 試劑盒，它具有下列特點：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 rna 模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)人類嗜 t 淋巴細胞病毒 1 型高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的 rna 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μl 體系的探針法熒光定量 rt-pcr 反應(yīng)。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
成分
編號
十孔盒包裝
探針法 qrt-pcr 緩沖液
190504a
500μl（藍蓋）
探針法 qrt-pcr 酶混合液
190504b
100μl（紅蓋）
熒光 pcr 專用模板稀釋液
180701
1 ml（黃蓋）
人類嗜 t 淋巴細胞病毒 1 型探針
15-87810yw
100 μl（白蓋）
法 qrt-pcr 引物混合液
人類嗜 t 淋巴細胞病毒 1 型
15-87810pb
50 μl（棕色管）
qrt-pcr 探針
人類嗜 t 淋巴細胞病毒 1 型探針
法 qrt-pcr 陽性對照
60908-87810pc
50 μl（黃蓋）
(1×10e8 拷貝/μl)
使用手冊
15-87810sc
1 份
人類嗜t淋巴細胞病毒1型探針法熒光定量rt-pcr試劑盒使用方法
一、稀釋標準曲線樣品（以 10e2-10e7 拷貝/μl 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 dna 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μl 熒光 rt-pcr 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 7 號管中加入 5 μl 1×10e8 拷貝/μl 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10e7 拷貝/μl 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μl 1×10e7 拷貝/μl 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10e6 拷貝/μl 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μl 1×10e6 拷貝/μl 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10e5 拷貝/μl 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 rna 的制備
7.如果有 n 個樣品，最好設(shè)置 n+2 個提取，多出的一個是 pc（樣品制備陽性對照），一個是 nc（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μl 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為pc。另外用水作為nc。
8.用自選方法純化樣品的 rna，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 rna 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 rnaout。
三、probe qrt-pcr 反應(yīng)（20μl 體系，在樣品制備室進行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標記 n+9 個 pcr 管，其中 n+2 個用于上步得到的 n+2 個樣品，1 個用于 pcr 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標記 n+4 個 pcr 管，其中 n+2 個用于上步得到的 n+2 個樣品，1 個用于 pcr 陰性對照（用水做模板），1 個用于 pcr 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分
陰性對照
樣品管
n+2 個
管
（2-7 管）
探針法 qrt-pcr 緩沖液
各 10 μl
10 μl
各 10 μl
探針法 qrt-pcr 酶混合液
各 2 μl
2 μl
各 2 μl
人類嗜 t 淋巴細胞病毒 1 型 qrt-
各 1 μl
1 μl
各 1 μl
pcr 探針
人類嗜 t 淋巴細胞病毒 1 型探針
各 2 μl
2 μl
各 2 μl
法 qrt-pcr 引物混合液
待測樣品 rna 模板
各 5 μl
-
-
超純水
-
5 μl
-
各 5 μl（2
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液
-
-
號樣到2號
（2-7 號）
管，3 號樣到
3 號管…）
11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qrt-pcr：
過程
溫度
時間
逆轉(zhuǎn)錄
50℃
30 min
預(yù)變性
94℃
10 min
qrt-pcr 反應(yīng)
94℃
15 sec
（40 個循環(huán)）
60℃
1 min（采集 fam 通道的熒光信號）
五、數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 ct 值從標準曲線上推算出樣品 rna 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。人類嗜t淋巴細胞病毒1型探針法熒光定量rt-pcr試劑盒