大腸埃希氏菌的檢測(cè)方法及應(yīng)用！
一、背景及概述
大腸埃希氏菌簡稱大腸桿菌，系人和溫血?jiǎng)游锖竽c段正常菌叢的主要成員之一，具有菌體 (o)、莢膜 (k) 和鞭毛 (h) 3種抗原，已確定的o抗原群有164個(gè)(序號(hào)排至171)、k抗原72個(gè)(序號(hào)排至103)、h抗原55個(gè)(序號(hào)排至57)。已知的血清型高達(dá)數(shù)千種。通常無病原性或?yàn)闂l件致病菌，但數(shù)目有限的血清型為初生幼畜腹瀉的常見病原菌，它們具有粘著素性菌毛和腸毒素兩種致病因子，故名產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic e.coli，etec)。這類菌maozhu要有豬源etec的k88(f4)和987p(f6)以及豬、牛、羊源etec的k99 (f5) 和f41四種，均系蛋白質(zhì)，能特異地吸附于宿主小腸上皮細(xì)胞上。
腸毒素是引起腹瀉的直接致病因子，分不耐熱腸毒素(lt)和耐熱腸毒素(st)兩種，多數(shù)k88+etec可產(chǎn)生lt和st，而具其他粘著素性菌毛者一般只產(chǎn)st。有上述菌毛的etec常與一定的o抗原群相聯(lián)系。引起斷奶仔豬腹瀉的大腸桿菌也常局限于某些特定的o抗原群。少數(shù)β溶血大腸桿菌能產(chǎn)生神經(jīng)毒素，是仔豬水腫病病原。本菌對(duì)幼兔可致腹瀉和敗血癥;對(duì)雞能引起腸炎、敗血癥、腹膜炎、氣囊炎和肉芽腫；對(duì)產(chǎn)卵母鵝和種公鵝可致生殖器官感染。在基因工程中被廣泛應(yīng)用，作為質(zhì)粒的接受菌和基因表達(dá)。
二、檢測(cè)方法
檢測(cè)大腸埃希氏菌等的傳統(tǒng)方法包括多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法適用于各種樣品，但操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長，濾膜法主要用于檢測(cè)雜質(zhì)較少的水樣，操作比多管發(fā)酵法更為簡單，但是不適合檢測(cè)高濁度和其他復(fù)雜水樣。這兩種方法都具有檢測(cè)周期長，程序繁瑣的缺點(diǎn)，難以適應(yīng)污染源快速診斷的需要。
目前，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展了一些新方法進(jìn)行大腸埃希氏菌等的快速檢測(cè)，主要包括酶底物法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(pcr)、免疫分析法、生物傳感器法等。其中酶底物法是已經(jīng)納入國標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù) (pcr)、免疫分析法、生物傳感器法等方法還不成熟。與傳統(tǒng)方法相比，國標(biāo)酶底物法雖然將檢測(cè)時(shí)間縮短至24h，但是仍然不能滿足快速檢測(cè)的需要。以酶底物法為原理開發(fā)出來的在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀器價(jià)格昂貴，而且基本上都是以進(jìn)口產(chǎn)品為主。
cn201410354559.4提供一種檢測(cè)水中大腸埃希氏菌的方法，該方法能夠快速檢測(cè)出水中大腸埃希氏菌。提供如下技術(shù)方案：
步驟一、提供一系列不同濃度的大腸埃希氏菌菌懸液，濃縮，分別加入到檢測(cè)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后記錄各濃度下的大腸埃希氏菌菌懸液的特征時(shí)間，所述特征時(shí)間為各濃度下的大腸埃希氏菌菌懸液在365nm激發(fā)光下產(chǎn)生 450nm熒光的熒光強(qiáng)度達(dá)到240時(shí)的時(shí)間，建立大腸埃希氏菌菌懸液濃度和 特征時(shí)間的線性方程；
步驟二、將待測(cè)水樣濃縮，加入步驟1所述檢測(cè)培養(yǎng)液培養(yǎng)，在其410nm 吸光度有明顯變化的前提下，記錄待測(cè)水樣特征時(shí)間，將其代入到步驟1中的線性方程中獲得待測(cè)水樣中大腸埃希氏菌的濃度；其中，所述檢測(cè)培養(yǎng)液包括tryptone、*、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銨、氯化鈉、氯化鈣、亞硫酸鈉、吐溫-80、nah2po4·h2o、k2hpo4·3h2o、 鄰硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷、4-甲基傘形酮-β-d-葡萄糖醛酸苷、3號(hào)膽鹽。
在本檢測(cè)方法中，只有吸光度有明顯變化且熒光強(qiáng)度達(dá)到所設(shè)定的閾值240，才可認(rèn)定為存在大腸埃希氏菌，然后通過熒光強(qiáng)度定量檢測(cè)出水樣的大腸埃希氏菌濃度。如果只有吸光度有明顯變化，而熒光強(qiáng)度超過10h未達(dá)到閾值240，或者只有熒光強(qiáng)度在10h內(nèi)達(dá)到閾值240，但吸光度未有明顯變化，則不能認(rèn)定待測(cè)水樣中存在大腸埃希氏菌。雙標(biāo)準(zhǔn)的選擇*地增加了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，杜絕了其他影響因素的干擾。發(fā)明基于酶底物法的原理，以吸光度和熒光強(qiáng) 度為標(biāo)準(zhǔn)，采用適合于大腸埃希氏菌的檢測(cè)培養(yǎng)液，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出水中大腸埃希氏菌的濃度，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水中微生物污染情況。
三、應(yīng)用
2′-脫氧腺苷(2-deoxyadenosine)是天然的脫氧核苷，是脫氧核糖核酸(dna)的有 機(jī)組成部分，也是基因藥物和基因工程研究的重要原材料，具有很好的生理活性。2′-脫氧腺苷本身有一定藥用價(jià)值，可抑制由糖誘導(dǎo)的胰島素釋放，并且能夠降低特異性磷酸二脂酶抑制劑或腺苷環(huán)化酶激活劑促進(jìn)胰島素分泌的作用。雖未有報(bào)道其可直接用于抗病毒，但是可作為一種重要的原料，經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)改造得到的2′-脫氧腺苷類似物是很多抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病核苷類藥物的良好中間體。
cn201410387566提供一種利用大腸埃希氏菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2′-脫氧腺苷的方法，通過直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大腸埃希氏菌菌體作為酶源，將其與作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)底物的脫氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)合成2′-脫氧腺苷。
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